RNA酶保护试验方法

RNA酶保护试验方法

RNA酶保护法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。

目录

· 一、 RNA酶保护试验的介绍

· 二、试剂准备

· 三、操作步骤

· 四、电泳与放射自显影

· 五、注意事项

· 六、技术文档

RNA酶保护试验是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。

一、 RNA酶保护试验的介绍

RNA酶保护试验（RNase Protection Assay，RPA） 是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern blot和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：

1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。

2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台"问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。

3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。

4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。

5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。

6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。

7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。

RPA的缺点是需要同位素标记探针。

二、试剂准备

1. GACU POOL：取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 杂交缓冲液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液：5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl（pH7.4） 20μl.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.RNase A（10mg/ml） 8μl.RNase T1（250U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2ml

三、操作步骤

（一） 反义RNA制备

可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。

1.设计含T7启动子的PCR引物

由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列: T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示

2.PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR。

3.探针合成标记与纯化

在0.5ml 离心管中加入下列试剂：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP.CTP.ATP各2.75 mM，UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP（10μCi/μl） 2.5μl

DTT （二硫苏糖醇，0.1M） 1μl

5×转录 buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶 （15U） 1μl

混合后，短暂离心，37℃保温1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl） 1μl， 37℃ 15min， 然后75 ℃ 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：饱和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl

室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0 .5ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl，预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20℃静置30min。4℃离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4℃离心13500g×2min， 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

（二） 杂交

1.RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。

2.取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整） 于0.5ml 离心管中。

3.80℃保温2min，然后40-45℃下杂交12-18hr。

（三） 消化

1.杂交管于37 ℃保温15min，加入RNase消化液，37 ℃保温30min。

2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 ℃保温10min。

3.加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。

4.转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20℃ 30min，4 ℃离心，135000g×10min。

5.弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。

四、电泳与放射自显影

（一） 配制凝胶：（50ml）

40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

（二） 预电泳（50ml）

以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 ℃。待胶板温度达50 ℃时，暂停电泳，准备加样。

（三） 加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品80 ℃加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳） 。

（四） 电泳结束

电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影.定影.水洗.晾干。

五、注意事项

1.本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2.RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。

3.同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。

4.RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用